सामग्री लपवा
1 युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेल-सेक लक्ष्य संवर्धन
2 उत्पादन वापर सूचना
3 परिचय
4 किट सामग्री
5 उपभोग्य वस्तू आणि उपकरणे (दिलेली नाही)
6 TELL-Seq™ ह्युमन एक्सोम कॅप्चर वर्कफ्लो
7 प्रोटोकॉल
8 तयारी
9 मणी धुवा
10 Amplify लायब्ररी
11 लायब्ररी साफ करा
12 टार्गेट एनरिचमेंटसाठी लायब्ररी पात्र आणि क्वांटिफाइड करा
13 Exome कॅप्चर पॅनेलमध्ये TELL-Seq™ लायब्ररीला संकरित करा
14 Streptavidin-लेपित चुंबकीय मणी तयार करा
15 स्ट्रेप्टाव्हिडिन-लेपित मणी वापरून हायब्रिडाइज्ड डीएनए कॅप्चर करा
16 Amplify कॅप्चर केलेली लायब्ररी
17 अनुक्रमणासाठी कॅप्चर केलेली लायब्ररी पात्र आणि प्रमाणीकरण करा
18 कागदपत्रे / संसाधने
18.1 संदर्भ
19 संबंधित पोस्ट

युनिव्हर्सल-अनुक्रमण-लोगो

युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेल-सेक लक्ष्य संवर्धन

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-उत्पादन-प्रतिमा

तपशील:

  • उत्पादनाचे नाव: TELL-SeqTM लक्ष्य संवर्धन
  • यासाठी: केवळ संशोधन वापरा, निदान प्रक्रियेसाठी नाही
  • निर्माता: युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेक्नॉलॉजी कॉर्पोरेशन
  • आवश्यक जीनोमिक डीएनए: 5ng
  • स्टोरेज अटी: ट्रिस बफर pH 7.5-8.0 किंवा कमी TE बफर

उत्पादन वापर सूचना

जीनोमिक डीएनए इनपुट शिफारसी:
तुमच्याकडे प्रोटोकॉलसाठी किमान 5ng जीनोमिक डीएनए असल्याची खात्री करा. यशस्वी अनुक्रमासाठी उच्च आण्विक वजन डीएनए महत्त्वपूर्ण आहे. Qubit dsDNA BR Assay Kit किंवा HS Kit सारख्या फ्लोरोमेट्रिक-आधारित पद्धतीचा वापर करून DNA चे प्रमाण निश्चित करा. मोजमाप करण्यापूर्वी ट्रिस बफरमध्ये एकाग्र DNA कार्यरत एकाग्रतेपर्यंत (0.4ng/l ते 1ng/l) पातळ करा. पीएच 7.5-8.0 किंवा कमी टीई बफरसह ट्रिस बफरमध्ये जीनोमिक डीएनए साठवा.

किट सामग्री:

TELL-SeqTM लायब्ररी प्रेप किट, मानक आकारात दोन असतात बॉक्स:

  • बॉक्स 1: बारकोडिंग एंझाइम, एक्सोन्युक्लीझ आणि बरेच काही यासह विविध अभिकर्मक असतात.
  • बॉक्स 2: टेल बीड प्लेक्सब, वॉश सोल्युशन आणि स्टॉप सोल्यूशन समाविष्ट आहे.

टीप: बॉक्स 1 अभिकर्मक 6 पेक्षा जास्त वेळा गोठवू नका आणि वितळवू नका.

वारंवार विचारले जाणारे प्रश्न:

  1. प्रश्न: मी फ्लोरोमेट्रिक-आधारित पद्धतींशिवाय इतर पद्धती वापरू शकतो का? डीएनएचे प्रमाण ठरवायचे?
    A: अचूक मापनासाठी क्यूबिट dsDNA BR Assay Kit किंवा HS Kit सारखी फ्लोरोमेट्रिक-आधारित पद्धत वापरण्याची शिफारस केली जाते. केवळ एकूण न्यूक्लिक ॲसिड एकाग्रता मोजणाऱ्या पद्धती टाळा.
  2. प्रश्न: इष्टतम परिणामांसाठी मी जीनोमिक डीएनए कसा संग्रहित करावा?
    A: उत्कृष्ट परिणामांसाठी जीनोमिक DNA 7.5 - 8.0 किंवा कमी TE बफर (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) पर्यंत pH असलेल्या Tris बफरमध्ये संग्रहित केले पाहिजे.

फक्त संशोधनासाठी वापरा. निदान प्रक्रियेत वापरण्यासाठी नाही.
दस्तऐवज # 100032-USG v4.0
ऑगस्ट २०२४
हा दस्तऐवज युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेक्नॉलॉजी कॉर्पोरेशनच्या मालकीचा आहे आणि तो केवळ त्याच्या ग्राहकाच्या वापरासाठी येथे वर्णन केलेल्या उत्पादनांच्या वापरासाठी आहे आणि इतर कोणत्याही हेतूंसाठी नाही. TELL-Seq™ किटचा योग्य आणि सुरक्षित वापर सुनिश्चित करण्यासाठी या दस्तऐवजातील सूचना योग्यरित्या प्रशिक्षित कर्मचाऱ्यांनी तंतोतंत पाळल्या पाहिजेत.
युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेक्नॉलॉजी कॉर्पोरेशन TELL-SEQ™ किटच्या चुकीच्या वापरानंतर उद्भवणारे कोणतेही दायित्व गृहीत धरत नाही.
©2023 युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेक्नॉलॉजी कॉर्पोरेशन. सर्व हक्क राखीव. TELL-Seq™ हे युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेक्नॉलॉजी कॉर्पोरेशनचे ट्रेडमार्क आहे. इतर सर्व नावे, लोगो आणि इतर ट्रेडमार्क त्यांच्या संबंधित मालकांची मालमत्ता आहेत.

पुनरावृत्ती इतिहास

डॉक #100032-USG v1.0 नोव्हेंबर २०२४ प्रारंभिक प्रकाशन
डॉक #100032-USG v2.0 ऑगस्ट २०२४ सस्पेंशन बफर ईझेड आणि टेल बीड प्लेक्स पर्यायासह अपडेट केलेल्या TELL- Seq™ लायब्ररी प्रेप किट V1 सह कार्य करण्यासाठी प्रोटोकॉल अपडेट
डॉक # 100032-USG v3.0 ऑगस्ट २०२४ TELL Bead पर्याय काढला. पुढे जाण्यासाठी फक्त TELL Bead Plex वापरला जातो. उच्च आण्विक वजन डीएनए गुणधर्म जतन करण्यासाठी बारकोडिंग प्रक्रियेदरम्यान योग्य ट्यूब रोटेशनच्या महत्त्वपूर्ण टप्प्यासाठी शिफारस केलेल्या मिक्सिंग सिस्टमसह एक टीप आणि एक चित्र जोडले.
डॉक # 100032-USG v4.0 ऑगस्ट २०२४ सामान्य लक्ष्य संवर्धनासाठी वापरकर्ता मार्गदर्शक बदलला. इतर लक्ष्य संवर्धन प्रणालीसह TELL-Seq™ लायब्ररी तयारी वापरण्याबद्दल अतिरिक्त माहिती जोडली

परिचय

हा प्रोटोकॉल TELL-Seq™ लायब्ररी प्रेप किट आणि Agilent® SureSelect टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टमच्या संयोजनाचा वापर करून हायब्रीडायझेशन कॅप्चरद्वारे लक्ष्य समृद्ध अनुक्रमित पेअर-एंड TELL-Seq™ लायब्ररी कशी तयार करावी हे स्पष्ट करते. TELL-Seq™ लायब्ररी प्रेप किट प्रणाली इतर लक्ष्य संवर्धन प्रणाली जसे की IDT आणि ट्विस्ट बायोसायन्सेसशी सुसंगत आहे.
TELL-Seq™ लायब्ररी प्रीप किट एक नाविन्यपूर्ण ट्रान्सपोसेस एंझाइम लिंक्ड लाँग-रीड सिक्वेन्सिंग (TELL-Seq™) तंत्रज्ञान वापरते † एक Illumina® सिक्वेन्सिंग सिस्टममधून बारकोड लिंक्ड रीड्स व्युत्पन्न करण्यासाठी पेअर-एंड लायब्ररी तयार करण्यासाठी. Agilent® SureSelect टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टम अत्यंत विशिष्ट कॅप्चर प्रोबचा वापर करून लक्ष्यित क्षेत्रांच्या समृद्धीसाठी परवानगी देते. प्रत्येक टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टममध्ये प्रोबचे एक अनन्य पॅनेल असते जे TELL-Seq™ लायब्ररीशी सुसंगत असलेल्या विशिष्ट प्रदेशांना कॅप्चर करण्यास परवानगी देते.

जीनोमिक डीएनए इनपुट शिफारसी
या प्रोटोकॉलसाठी 5ng जीनोमिक डीएनए आवश्यक आहे. उच्च आण्विक वजन (HMW) DNA यशस्वी TELL-Seq™ अनुक्रमासाठी महत्त्वपूर्ण आहे.

  • मानवी जीनोमसाठी, किमान एसample DNA चा आकार 40Kb पेक्षा जास्त असावा.
  •  100Kb ते 300Kb पर्यंतचा HMW DNA सर्वोत्तम मानवी फेजिंग ऍप्लिकेशनसाठी इष्टतम सामग्री आहे.
  • हाताळणी दरम्यान HMW DNA तोडणे टाळा. s मध्ये कमी आण्विक वजन डीएनए काढा (जेलवर 10Kb पेक्षा कमी स्मीअर म्हणून ओळखले जाते)ample जर ते DNA s मध्ये महत्त्वपूर्ण भाग सादर करतातampले

इनपुट डीएनए परिमाण करण्यासाठी फ्लोरोमेट्रिक-आधारित पद्धत वापरा. तुम्ही Qubit dsDNA BR Assay Kit किंवा HS Kit वापरत असल्यास, प्रत्येक DNA च्या किमान 2 µL वापरा.ampमापनासाठी le. नॅनोड्रॉप किंवा इतर अतिनील शोषक पद्धतींसारख्या केवळ एकूण न्यूक्लिक ॲसिड एकाग्रता मोजणाऱ्या पद्धती टाळा. HMW DNA एकाग्रतेच्या अचूक मापनासाठी, एकाग्रता मापन आणि लायब्ररी तयार होण्यापूर्वी अनेक तास ते एक दिवस आधी Tris बफर (pH 0.4-1) मध्ये केंद्रित DNA कार्यरत एकाग्रतेमध्ये (7.5ng/µl ते 8.0ng/µl) पातळ करा. जीनोमिक डीएनए 7.5 - 8.0 किंवा कमी TE बफर (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) पर्यंत pH असलेल्या Tris बफरमध्ये संग्रहित केले पाहिजे. डीएनएच्या शुद्धतेचे मूल्यांकन करण्यासाठीample, शोषक मापन 260 nm ते 280 nm शोषकतेचे गुणोत्तर वापरले जाऊ शकते. हा प्रोटोकॉल 1.8-2.0 च्या शोषक गुणोत्तर मूल्यांसह DNA साठी ऑप्टिमाइझ केला आहे. DNA मध्ये जास्त RNA असल्यास sampतथापि, ते RNase उपचाराने काढले पाहिजे.

किट सामग्री

TELL-Seq™ लायब्ररी प्रीप किट, मानक आकार (2 बॉक्स)

1 पैकी बॉक्स 2: TELL-Seq™ लायब्ररी अभिकर्मक बॉक्स 1 V1 (PN 100035)

टीप: बॉक्स 1 अभिकर्मक 6 पेक्षा जास्त वेळा गोठवू नका आणि वितळवू नका.

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(1)

a 10× प्राइमर II सह TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टीप्लेक्स प्राइमर किट लायब्ररीसाठी एकत्र वापरण्यासाठी ampबंधन

2 पैकी बॉक्स 2: TELL-Seq™ लायब्ररी अभिकर्मक बॉक्स 2 V1 (PN 100036)

घटकाचे नाव टोपी रंग खंड (mL) स्टोरेज तापमान
बीड प्लेक्स सांगाb युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(2)कॅप ऑरेंज 76 2°C ते 8°C
धुण्याचे समाधान युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3)कॅप पांढरा 4500 2°C ते 8°C
उपाय थांबवाc युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4)CAP नैसर्गिक 960 2°C ते 25°C

b TELL Bead Plex इलुमिना आणि नॉन-इलुमिना सिक्वेन्सिंग सिस्टीम या दोन्हींवर चांगले कार्य करते.
c वापरण्यापूर्वी, जर स्टॉप सोल्यूशन स्पष्ट नसेल किंवा पांढरे अवक्षेपण असेल तर, ट्यूब 37°C वर गरम करा. कोणत्याही अवक्षेपण विरघळण्यासाठी भोवरा. पहिल्या वापरानंतर, भविष्यातील वापरासाठी पुन्हा सस्पेंड केलेले स्टॉप सोल्यूशन खोलीच्या तापमानावर साठवा.

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(5)खबरदारी

 TELL Bead Plex सह तयार केलेल्या TELL-Seq™ लायब्ररींमधून व्युत्पन्न केलेल्या अनुक्रम डेटाचे विश्लेषण करण्यासाठी TELL-Read पाइपलाइन v1.1 किंवा त्यावरील आवश्यक आहे.

TELL-Seq™ लायब्ररी प्रेप किट, HT24 (2 बॉक्स)
1 पैकी बॉक्स 2: TELL-Seq™ लायब्ररी अभिकर्मक बॉक्स 1 V1, HT24 (PN 100037) 

टीप: बॉक्स 1 अभिकर्मक 6 पेक्षा जास्त वेळा गोठवू नका आणि वितळवू नका. युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(6)

a 10× प्राइमर II सह TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टीप्लेक्स प्राइमर किट लायब्ररीसाठी एकत्र वापरण्यासाठी ampबंधन

2 पैकी बॉक्स 2: TELL-Seq™ लायब्ररी अभिकर्मक बॉक्स 2 V1, HT24 (PN 100038)

घटकाचे नाव टोपी रंग खंड स्टोरेज तापमान
बीड प्लेक्स सांगाb युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(2) संत्रा 456 मिली 2°C ते 8°C
धुण्याचे समाधान युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(7) निळा 28.5 मिली 2°C ते 8°C
उपाय थांबवाc युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) पांढरा 5.76 मिली 2°C ते 25°C

b TELL Bead Plex इलुमिना आणि नॉन-इलुमिना सिक्वेन्सिंग सिस्टीम या दोन्हींवर चांगले कार्य करते.
c वापरण्यापूर्वी, जर स्टॉप सोल्यूशन स्पष्ट नसेल किंवा पांढरे अवक्षेपण असेल तर, ट्यूब 37 डिग्री सेल्सियस वर गरम करा. कोणत्याही अवक्षेपण विरघळण्यासाठी भोवरा. पहिल्या वापरानंतर, भविष्यातील वापरासाठी पुन्हा सस्पेंड केलेले स्टॉप सोल्यूशन खोलीच्या तापमानावर ठेवा.

प्रो टीप: दोन TELL-Seq™ लायब्ररी प्रेप किट, HT24 बॉक्स 1 आणि बॉक्स 2 या दोन्हीसह कोणत्याही TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टिप्लेक्स प्राइमर किट्ससह जोडू शकतात.

खबरदारी 
TELL Bead Plex सह तयार केलेल्या TELL-Seq™ लायब्ररींमधून व्युत्पन्न केलेल्या अनुक्रम डेटाचे विश्लेषण करण्यासाठी TELL-Read पाइपलाइन v1.1 किंवा त्यावरील आवश्यक आहे.

TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टीप्लेक्स प्राइमर (1-8) किट (PN 100003)

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(9) युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(10)

प्रो टीप: एका TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टिप्लेक्स प्राइमर (1-8) किटमध्ये चार TELL-Seq™ WGS लायब्ररी प्रेप किट्ससह वापरण्यासाठी पुरेसे प्राइमर्स आहेत.

TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टीप्लेक्स प्राइमर (9-16) किट (PN 100009)

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(11)

प्रो टीप: एक TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टिप्लेक्स प्राइमर (9-16) किटमध्ये चार TELL-Seq™ WGS लायब्ररी प्रेप किट, मानक आकारासह वापरण्यासाठी पुरेसे प्राइमर्स आहेत.

TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टीप्लेक्स प्राइमर (17-24) किट (PN 100010)

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(12)

प्रो टीप: एक TELL-Seq™ लायब्ररी मल्टिप्लेक्स प्राइमर (17-24) किटमध्ये चार TELL-Seq™ WGS लायब्ररी प्रेप किट, मानक आकारासह वापरण्यासाठी पुरेसे प्राइमर्स आहेत.

TELL-Seq™ Illumina® सिक्वेन्सिंग प्राइमर किट (PN 100004)

घटकाचे नाव टोपी रंग एकाग्रता खंड (mL) स्टोरेज तापमान
1 प्राइमर वाचा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(8) काळा 100mM 50 -25°C ते -15°C
2 प्राइमर वाचा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) पांढरा 100mM 50 -25°C ते -15°C
अनुक्रमणिका 1 प्राइमर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) लाल 100mM 50 -25°C ते -15°C
अनुक्रमणिका 2 प्राइमर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-24 पिवळा 100mM 50 -25°C ते -15°C

TELL-Seq™ लक्ष्य अवरोधक (PN 100019)

घटकाचे नाव टोपी रंग खंड (mL) स्टोरेज तापमान
TELL-Seq™ लक्ष्य अवरोधक कॅप पांढरा 40 -25°C ते -15°C

उपभोग्य वस्तू आणि उपकरणे (दिलेली नाही)

उपभोग्य वस्तू

उपभोग्य पुरवठादार
0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
20 मिली पिपेट टीप (मानक आणि रुंद छिद्र) सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
200 मिली पिपेट टीप (मानक आणि रुंद छिद्र) सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
आण्विक जीवशास्त्रासाठी इथेनॉल 200 प्रूफ (निरपेक्ष) (500 एमएल) सिग्मा-अल्ड्रिच, # E7023
Nuclease- मुक्त पाणी सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
AMPure XP बेकमन, # A63880
Agilent Bioanalyzer उच्च संवेदनशीलता DNA विश्लेषण किट* Agilent, # 5067-4626
टेपस्टेशन उच्च संवेदनशीलता D5000 स्क्रीनटेप परख* Agilent, # 5067-5592, #5067-5593
Qubit dsDNA HS Assay Kit थर्मो फिशर सायंटिफिक, # Q32851 किंवा Q32854
Qubit Assay Tubes थर्मो फिशर सायंटिफिक, # Q32856
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 थर्मो फिशर सायंटिफिक, # 65601, 65602 किंवा 65603
Agilent SureSelect XT HS Capture Library Human All Exon 7 Agilent, # G9704N, G9705N किंवा G9706N
Agilent SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट, ILM Hyb मॉड्यूल (PCR पोस्ट), 16 Rxn Agilent, #G9916B
TE बफर, pH 8.0 सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार

*वापरकर्ता सुविधेत कोणती प्रणाली उपलब्ध आहे यावर अवलंबून आहे.

उपकरणे

उपकरणे पुरवठादार
थर्मो सायकलर अप्लाइड बायोसिस्टम
0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबसाठी चुंबकीय स्टँड सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
ट्यूब रोटेटर सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
इनक्यूबेटर (३५°C साठी) सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
भोवरा सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
Agilent Bioanalyzer* चपळ
एजिलेंट टेपस्टेशन* चपळ
Qubit® फ्लोरोमीटर 3.0 थर्मो फिशर सायंटिफिक, # Q33216, Q33217 किंवा Q33218
बर्फाची बादली सामान्य प्रयोगशाळा पुरवठादार
SpeedVac व्हॅक्यूम कॉन्सन्ट्रेटर्स (पर्यायी) थर्मो फिशर सायंटिफिक

*वापरकर्ता सुविधेत कोणती प्रणाली उपलब्ध आहे यावर अवलंबून आहे.

TELL-Seq™ ह्युमन एक्सोम कॅप्चर वर्कफ्लो

TELL-Seq™ WGS लायब्ररी तयारी

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(14)

प्रोटोकॉल

TELL-Seq™ WGS लायब्ररी तयारी
खालील प्रोटोकॉल मानवी DNA वापरून TELL-Seq™ लायब्ररी प्रेप किटसह सुधारित TELL-Seq™ संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण लायब्ररी तयारी प्रक्रियेचे वर्णन करते.ampलेस भिन्न जीनोमिक डीएनए एसampसमान प्रोटोकॉलचे अनुसरण करून le प्रकार देखील बदलले जाऊ शकतात. TELL-Seq™ लायब्ररी इतर लक्ष्य संवर्धन प्रणालींशी सुसंगत आहेत, परंतु SureSelect Human All Exon V8 कॅप्चर प्रोबचा वापर करून Agilent SureSelectXT HS टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टमचा वापर केला जातो.ampप्रोटोकॉल मध्ये. इतर टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टम्समध्ये वापरण्यासाठी कृपया योग्य लायब्ररी तयार करण्यासाठी TELL-Seq™ लायब्ररी प्रीप (पृ. 10-22) साठी प्रोटोकॉल फॉलो करा. TELL-Seq™ लायब्ररी प्रत्येक विशिष्ट टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टमच्या प्रोटोकॉलनुसार डीएनए इनपुट म्हणून वापरल्या जाऊ शकतात आणि TELL-Seq™ टार्गेट ब्लॉकर्सच्या व्यतिरिक्त वापरल्या जाणाऱ्या ब्लॉकर्सचा वापर केला जाऊ शकतो.

बारकोड डीएनए

उपभोग्य वस्तू
➢ इनपुट जीनोमिक डीएनए (वापरकर्ता)

जीनोम आकार इनपुट रक्कम प्रतिक्रिया खंड (mL) तयारी/किट
मोठा (मानवी) 5 एन.जी 150 4

टीप: 

  1. जीनोमिक डीएनए 7.5 ते 8.0 पर्यंत pH किंवा कमी TE बफर (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) असलेल्या Tris बफरमध्ये संग्रहित आणि पातळ केले पाहिजे.

➢ 5× रिॲक्शन बफर (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(7) निळा)
➢ कोफॅक्टर II (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(15) अंबर)
➢ बारकोडिंग एन्झाइम (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(8) काळा)
➢ टेल बीड किंवा टेल बीड प्लेक्स (किट बॉक्स 2, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(2) संत्रा)
➢ निलंबन बफर EZ (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) नैसर्गिक)
➢ न्यूक्लीज-मुक्त पाणी (वापरकर्ता)
➢ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)
➢20 µL आणि 200 µL रुंद छिद्र पिपेट टिपा (वापरकर्ता)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    5× प्रतिक्रिया बफर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(7) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर   थोडक्यात अपकेंद्रित्र. बर्फावर ठेवा.
    कोफॅक्टर II युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(15) -25°C ते -15°C मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. येथे ठेवा अंधारात खोलीचे तापमान. ट्यूब बंद करा   प्रत्येक वापरानंतर घट्ट टोपी घाला. 
    बारकोडिंग एन्झाइम युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(8) -25°C ते -15°C मिसळण्यासाठी ट्यूब 4 ते 5 वेळा फ्लिक करा. सेंट्रीफ्यूज थोडक्यात बर्फावर ठेवा.  
    बीड प्लेक्स सांगा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(2) 2°C ते 8°C सेंट्रीफ्यूज थोडक्यात. बर्फावर ठेवा. ट्यूब कॅप बंद करा  प्रत्येक वापरानंतर घट्ट बाष्पीभवन टाळण्यासाठी.
    निलंबन बफर EZ युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. येथे ठेवा खोलीचे तापमान.
    Nuclease- मुक्त पाणी खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
  2. 35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ट्यूब रोटेटर सेट करा (प्रक्रिया विभागाची पायरी 7 पहा).

खबरदारी
डीएनए खंडित होऊ नये म्हणून उच्च आण्विक वजन जीनोमिक डीएनए हस्तांतरित करण्यासाठी आणि मिक्स करण्यासाठी विस्तृत छिद्र पिपेट टिप्स वापरा. रुंद छिद्र असलेल्या विंदुक टिपा उपलब्ध नसल्यास, वापरण्यापूर्वी स्वच्छ रेझर ब्लेडने मानक विंदुक टिप टॉपपासून 2mm-3mm कापून टाका.

कार्यपद्धती

  1. व्होर्टेक्स टेल बीड प्लेक्स किमान 30 सेकंद जोमाने. नळीच्या झाकणावर किंवा बाजूला असलेले मणीचे द्रावण खाली आणण्यासाठी पल्स स्पिन (1 सेकंदापेक्षा जास्त नाही सेंट्रीफ्यूज). वापरण्यापूर्वी, TELL Bead Plex ला 200 µL टीप वर आणि खाली 5 वेळा पायपेट करा जेणेकरून सर्व मणी योग्यरित्या पुन्हा जोडले गेले आहेत याची खात्री करा.
  2. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबमध्ये, प्रत्येक प्रतिक्रिया खालील क्रमाने एकत्र करा.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    मोठा जीनोम (150 मिली)
    5× प्रतिक्रिया बफर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(7) 30
    Nuclease- मुक्त पाणी
    कोफॅक्टर II युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(15)    		 २० - झेड
    (Z हा DNA व्हॉल्यूम आहे)30
    बीड प्लेक्स सांगा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(2) (0.5M बारकोड/mL) 19
  3. 10 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून किंवा 5 सेकंद जोरदारपणे भोवरा करून चांगले मिसळा आणि द्रावण तळाशी आणण्यासाठी पल्स फिरवा. बारकोडिंग एन्झाइम जोडा.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    मोठा जीनोम
    बारकोडिंग एन्झाइम युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(8) 6 मिली
  4. 8 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून चांगले मिसळा. ट्यूबमध्ये द्रावणाच्या तळाशी पिपेटची टीप ठेवून पाईपिंग करताना हवेचे फुगे येणे टाळा.
  5. विस्तीर्ण छिद्र पिपेट टीप वापरा, खालील अभिकर्मक जोडा.
    युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-25टीप:     Suspension Buffer EZ हे अत्यंत चिकट पदार्थ आहे. सावधगिरीचा वापर करा आणि योग्य आवाज वितरित केला गेला आहे याची खात्री करण्यासाठी हळूहळू पिपेट करा.
  6. पिपेट व्हॉल्यूम 110 μL वर सेट करा. विस्तीर्ण छिद्रयुक्त पिपेट टीप वापरा, हळूवारपणे 6-8 वेळा वर आणि खाली पायपीट करून द्रावण हलक्या हाताने मिसळा. ट्यूबमध्ये सोल्युशनच्या तळाशी विंदुक टीप ठेवून पाईपिंग करताना अनेक हवेचे फुगे येणे टाळा.
  7. एस ठेवाampले ट्यूब ट्यूब रोटेटरवर 35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ठेवा आणि 10 मिनिटे हळू (15-30 आरपीएम) फिरवा.

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(16)

Sampले ट्यूब्स 35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ट्यूब रोटेटरवर ठेवल्या जातात.

टीप: HMW DNA गुणधर्म जतन करण्यासाठी आणि योग्य बारकोडिंग प्रक्रिया सुलभ करण्यासाठी योग्य ट्यूब रोटेशन महत्त्वपूर्ण आहे. शिफारस केलेले मिक्सिंग सिस्टम खाली (डावीकडे) दर्शविले आहेत. मिक्सिंग सिस्टीम ज्या फिरत नाहीत किंवा जोमदार थरथर निर्माण करतात त्या HMW DNA गुणधर्म आणि TELL-Seq च्या संरक्षणाशी विसंगत आहेत; यापैकी काही प्रणाली खाली (उजवीकडे) देखील दर्शविल्या आहेत.

युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(17)

डीएनए स्थिर करा 

उपभोग्य वस्तू
➢ स्टॅबिलायझर (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(18) व्हायलेट)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
आयटम स्टोरेज सूचना
स्टॅबिलायझरयुनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(18) -25°C ते -15°C मिसळण्यासाठी ट्यूब 4 ते 5 वेळा फ्लिक करा. सेंट्रीफ्यूज थोडक्यात. बर्फावर ठेवा.

कार्यपद्धती

  1. एस पुनर्प्राप्त कराamp35°C इनक्यूबेटरमधून le ट्यूब.
  2. ट्यूबमध्ये स्टॅबिलायझर घाला.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    मोठा जीनोम
    स्टॅबिलायझर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(18) 3
  3. पिपेट व्हॉल्यूम 110 μL वर सेट करा. विस्तीर्ण छिद्रयुक्त पिपेट टीप वापरा, हळूवारपणे 6-8 वेळा वर आणि खाली पायपीट करून द्रावण हलक्या हाताने मिसळा. अनेक बुडबुडे तयार करणे टाळा.
  4. एस ठेवाamp35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ट्यूब रोटेटरवर le ट्यूब परत करा आणि 10 मिनिटे हळू (15-30 rpm) फिरवा.

Tagडीएनए 

उपभोग्य वस्तू
➢ Tagजिंग एन्झाइम (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) लाल)
➢ एक्सोन्युक्लीज (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-24 पिवळा)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    Tagging एन्झाइम युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) -25°C ते -15°C मिसळण्यासाठी ट्यूब 4 ते 5 वेळा फ्लिक करा. सेंट्रीफ्यूज थोडक्यात बर्फावर ठेवा.
    Exonuclease युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-24 -25°C ते -15°C मिसळण्यासाठी ट्यूब 4 ते 5 वेळा फ्लिक करा. सेंट्रीफ्यूज

    थोडक्यात बर्फावर ठेवा.
  2. 35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये समान ट्यूब रोटेटर वापरा.

कार्यपद्धती

  1. एस पुनर्प्राप्त कराamp35°C इनक्यूबेटरमधून le ट्यूब.
  2. ॲड Tagट्यूबमध्ये एन्झाईम आणि एक्सोन्यूक्लीझ ging.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    मोठा जीनोम
    Tagging एन्झाइम युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) 2
    Exonuclease युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-24 3
  3. पिपेट व्हॉल्यूम 110 μL वर सेट करा. विस्तीर्ण छिद्रयुक्त पिपेट टीप वापरा, हळूवारपणे 8 वेळा वर आणि खाली पायपीट करून द्रावण हलक्या हाताने मिसळा. या चरणासाठी, मिश्रण खूप कसून असणे आवश्यक आहे. अनेक बुडबुडे तयार करणे टाळा.
  4. एस ठेवाamp35 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ट्यूब रोटेटरवर le ट्यूब परत करा आणि 10 मिनिटे हळूहळू फिरवा. आवश्यक असल्यास, भिन्न रक्कम Tagलायब्ररीचा आकार समायोजित करण्यासाठी ging एन्झाइमचा वापर केला जाऊ शकतो.
    टीप: जर जास्त वेळ घाला लायब्ररीला प्राधान्य दिले तर कमी रक्कम Tagging Enzyme प्रतिक्रिया मध्ये वापरले जाऊ शकते. दुसरीकडे, लहान इन्सर्ट लायब्ररीला प्राधान्य दिल्यास, 6µL पर्यंत Tagging Enzymes प्रतिक्रिया मध्ये वापरले जाऊ शकते.
  5. उष्मायनानंतर लगेच पुढील चरणावर जा.

मणी धुवा

उपभोग्य वस्तू

  • स्टॉप सोल्यूशन (किट बॉक्स 2, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) नैसर्गिक किंवा प्रथम वापरानंतर खोलीच्या तपमानावर संग्रहित)
  • वॉश सोल्यूशन (किट बॉक्स 2, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) पांढरा)
  • 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    उपाय थांबवा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) 2°C ते 25°C कोणत्याही precipitates तपासा. उपस्थित असल्यास, बफर 37°C वर 10 मिनिटांसाठी उबवा आणि ते विरघळत नाही तोपर्यंत भोवरा. खोलीच्या तपमानावर साठवा साठी  भविष्यातील वापर.
    धुण्याचे समाधान युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) 2°C ते 8°C खोलीच्या तपमानावर आणा.
  2. खालील प्रोग्रामसह थर्मो सायकलर सेट करा:
    • झाकणाचा पर्याय १०० डिग्री सेल्सिअस पर्यंत गरम करा
    • 63°C कायमचे

कार्यपद्धती

  1. एस ठेवाample ट्यूब चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा समाधान स्पष्ट होईपर्यंत.
  2. नलिका चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता सुपरनॅटंटला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  3. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा. s मध्ये 120 μL वॉश सोल्यूशन जोडाample ट्यूब. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी पिपेट. आवश्यक असल्यास, द्रावण खाली आणण्यासाठी नाडी फिरवा.
  4. एस ठेवाample ट्यूब 1 मिनिट किंवा सोल्यूशन स्पष्ट होईपर्यंत चुंबकीय स्टँडवर परत ठेवा.
  5. नलिका चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता सुपरनॅटंटला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  6. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा. ट्यूबमध्ये 80 µL स्टॉप सोल्युशन घाला.
  7. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी Pipet अनेक वेळा. आवश्यक असल्यास, द्रावण खाली आणण्यासाठी नाडी फिरवा.
  8. खोलीच्या तपमानावर ट्यूब 5 मिनिटे उबवा.
  9. एस ठेवाample ट्यूब 1 मिनिट किंवा सोल्यूशन स्पष्ट होईपर्यंत चुंबकीय स्टँडवर परत ठेवा.
  10. नलिका चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता सुपरनॅटंटला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  11. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा. PCR ट्यूबमध्ये 120 μL वॉश सोल्यूशन जोडा. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी पिपेट.
  12. सर्व मण्यांचे द्रावण नवीन 0.2ml PCR ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा.
  13. पीसीआर थर्मोसायकलवर 63 डिग्री सेल्सिअस तापमानात ट्यूब 3 मिनिटे उबवा.
  14. नवीन एस ठेवाample ट्यूब खोलीच्या तपमानावर चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत.
  15. नलिका चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता सुपरनॅटंटला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  16. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा. PCR ट्यूबमध्ये 120 μL वॉश सोल्यूशन जोडा. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी पिपेट. आवश्यक असल्यास, द्रावण खाली आणण्यासाठी नाडी फिरवा.
  17. पीसीआर थर्मोसायकलवर 63 डिग्री सेल्सिअस तापमानात ट्यूब 3 मिनिटे उबवा.
  18. एस ठेवाample ट्यूब खोलीच्या तपमानावर चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत.
  19. नलिका चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता सुपरनॅटंटला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या. उरलेले कोणतेही सुपरनॅटंट काढण्यासाठी P20 पिपेट वापरा.
  20. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा. वॉश सोल्यूशनच्या 20 μL मध्ये मणी पुन्हा लावा.

टीप
हा एक सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट आहे. धुतलेले मणी 2°C ते 8°C तापमानात दोन आठवडे साठवले जाऊ शकतात.

Amplify लायब्ररी

उपभोग्य वस्तू

  • 2× पीसीआर मास्टर मिक्स (किट बॉक्स 1, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(19) गुलाबी)
  • 10× प्राइमर I (किट बॉक्स 1,  युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3)पांढरा)
  • 10× प्राइमर II, T50# (मल्टीप्लेक्स प्राइमर किट)
  • न्यूक्लीज-मुक्त पाणी (वापरकर्ता)
  • 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    2× पीसीआर मास्टर मिक्स युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(19) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. ट्यूब 4 ते 5 फ्लिक करा  मिसळण्यासाठी वेळा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. बर्फावर ठेवा.    
    10× प्राइमर I युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात अपकेंद्रित्र. बर्फावर ठेवा. 
    10× प्राइमर II, T50# -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर  थोडक्यात अपकेंद्रित्र. बर्फावर ठेवा. 
    वाढवणारा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(20) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात अपकेंद्रित्र. खोलीच्या तपमानावर ठेवा. 
    Nuclease- मुक्त पाणी खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
  2. लायब्ररी सेट करा Ampथर्मो सायकलरवर लिफिकेशन प्रोग्राम (एलएपी) खालीलप्रमाणे:
    • 63°C 2 मिनिटे
    • 72°C 2 मिनिटे
    • 98°C 30 सेकंद
    • [98°C 15 सेकंद, 63°C 20 सेकंद, 72°C 30 सेकंद] x सायकल क्रमांक
    • 72°C 3 मिनिटे
    • 4°C कायमचे

टीप:
डाउनस्ट्रीम ऍप्लिकेशन्स आणि आवश्यकतांवर आधारित सायकल क्रमांक लवचिक आहे. 13 चक्रांसह प्रारंभ करण्याची शिफारस करा. उच्च सायकल क्रमांक संकरीकरण आणि कॅप्चरसाठी इनपुट म्हणून अधिक TELL-Seq लायब्ररी व्युत्पन्न करेल, परंतु अंतिम अनुक्रम विश्लेषणासाठी उच्च डुप्लिकेशन दर. लोअर सायकल नंबर डुप्लिकेशन रेट कमी करू शकतो, परंतु कमी डीएनए इनपुटमुळे कॅप्चर कार्यक्षमता कमी होऊ शकते आणि लायब्ररीची जटिलता कमी होऊ शकते. कृपया योग्य सायकल क्रमांक ठरवताना पुढील विचारांसाठी हायब्रिडायझेशन आणि कॅप्चरसाठी क्वालिफाई आणि क्वांटिफाई लायब्ररीचा शेवट पहा.

जीनोम आकार PCR साठी वापरलेले मणी (B) चे खंड पीसीआर व्हॉल्यूम सायकल क्रमांक
मोठा 20 मिली 75 मिली 12-14

कार्यपद्धती

  1. मणी पुन्हा सुरू करण्यासाठी 10 सेकंदांसाठी व्होर्टेक्स मणी जोमाने करा. सोल्यूशन खाली आणण्यासाठी पल्स स्पिन. 20 µL टीप वापरून, सर्व मणी योग्यरित्या पुन्हा लटकले आहेत याची खात्री करण्यासाठी मणी वर आणि खाली 5 वेळा पायपेट करा. ताबडतोब संपूर्ण मणीच्या द्रावणाची रक्कम नवीन पीसीआर ट्यूबमध्ये हस्तांतरित करा.
  2. PCR ट्यूब चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  3. ट्यूब चुंबकीय स्टँडवर असताना, मण्यांना त्रास न देता 20 µ L सुपरनॅटंट काढून टाका. चुंबकापासून पीसीआर ट्यूब काढा.
  4. PCR ट्यूबमध्ये खालील अभिकर्मक जोडा.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (µL)
    मोठा जीनोम (७५ μL)
    Nuclease- मुक्त पाणी 16 मिली
    2× पीसीआर मास्टर मिक्स युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(19) 37.5 मिली
    10× प्राइमर I युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) 7.5 मिली
    10× प्राइमर II, T50# 7.5 मिली
    वाढवणारा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(20) हिरवा 4.5 मिली
  5. व्हर्टेक्सिंग किंवा पाइपिंग करून चांगले मिसळा. सोल्यूशन खाली आणण्यासाठी पल्स स्पिन.
  6. थर्मल सायकलरवर ट्यूब ठेवा आणि योग्य संख्येच्या सायकलसह LAP प्रोग्राम (वर पहा) चालवा.
  7. पीसीआर नंतर ampलिफिकेशन, बायोएनालायझर किंवा टेपस्टेशनवर गुणवत्ता तपासणीसाठी 2 μL PCR उत्पादन वापरा. सूचनांसाठी क्वालिफाई आणि क्वांटिफाई लायब्ररी विभाग पहा.

प्रो टीप: जर QC तपासणीने लायब्ररीचे उत्पन्न तुलनेने कमी असल्याचे दाखवले, तर उर्वरित पीसीआर उत्पादन असलेली ट्यूब थर्मोसायकलकडे परत ठेवा आणि ampक्लीन अप लायब्ररी विभागात जाण्यापूर्वी आणखी एक किंवा दोन अतिरिक्त सायकलसाठी लाइफ करा.

टीप:
हा एक सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट आहे. PCR उत्पादन एका महिन्यासाठी -25°C ते -15°C तापमानात साठवले जाऊ शकते.

लायब्ररी साफ करा

उपभोग्य वस्तू

  • AMPure XP (वापरकर्ता)
  • आण्विक जीवशास्त्र (वापरकर्ता) साठी इथेनॉल 200 पुरावा (निरपेक्ष)
  • न्यूक्लीज-मुक्त पाणी (वापरकर्ता)
  • 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
आयटम स्टोरेज सूचना
ताजे 75% (v/v) इथेनॉल खोलीचे तापमान 400 mL प्रति s आवश्यक आहेampले १.५ मिली इथेनॉल (२०० प्रूफ) ०.५ मिली न्यूक्लीज-मुक्त पाण्यात मिसळा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा आणि खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
AMPure XP 2°C ते 8°C किमान 20 मिनिटे खोलीच्या तपमानावर आणा आणि वापरण्यापूर्वी मणी पुन्हा सुरू करण्यासाठी जोमाने भोवरा.
Nuclease- मुक्त पाणी खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
TE बफर, pH 8.0 खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.

कार्यपद्धती

  1. थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज एसampसर्व उपाय खाली आणण्यासाठी पीसीआर ट्यूब.
  2. ट्यूबला चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  3. ट्यूब चुंबकीय स्टँडवर असताना, मणींना त्रास न देता नवीन 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबमध्ये सुपरनॅटंट स्थानांतरित करा.
  4. विंदुकाने हस्तांतरित सुपरनॅटंट (पीसीआर उत्पादन) चे प्रमाण मोजा.
  5. PCR उत्पादनामध्ये 100 μL च्या एकूण व्हॉल्यूममध्ये खालील अभिकर्मक जोडा.
    अभिकर्मक व्हॉल्यूम प्रति प्रतिक्रिया
    पीसीआर उत्पादन 75 मिली
    Nuclease- मुक्त पाणी एकूण 100 एमएल पर्यंत
  6. भोवरा जोमाने पुन्हा निलंबित करण्यासाठी AMPure XP सोल्यूशन आणि 78 μL जोडा AMPure XP 100 μL पीसीआर उत्पादनामध्ये.
  7. 10 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून मिसळा.
  8. खोलीच्या तपमानावर 5 मिनिटे उष्मायन करा.
  9. ट्यूबला चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  10. त्रास न होता सुपरनॅटंट ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या AMPure मणी.
  11. चुंबकीय स्टँडवर ट्यूब ठेवताना, ट्यूबमध्ये 200 μL ताजे तयार केलेले 75% इथेनॉल घाला. 30 सेकंद बसू द्या.
  12. मणींना त्रास न देता वरवरच्या तपकिरी पदार्थाला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  13. ट्यूबला संपूर्ण वेळ चुंबकीय स्टँडवर ठेवून आणखी एकदा 11-12 चरणांची पुनरावृत्ती करा.
  14. चुंबकीय स्टँडवरील ट्यूब कॅपसह उघडी ठेवा आणि इथेनॉलच्या खुणा बाष्पीभवन करण्यासाठी ट्यूबला 1-2 मिनिटे कोरडे होऊ द्या. मणी जास्त वाळवू नका.
  15. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा आणि मण्यांना 20 μL न्यूक्लिझ-मुक्त पाणी घाला.
  16. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी पिपेट किंवा भोवरा. 5 मिनिटे बसू द्या.
  17. चुंबकीय स्टँडवर ट्यूब 1 मिनिट किंवा सोल्यूशन स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  18. एका नवीन ट्यूबमध्ये 18 μL सुपरनॅटंट पुनर्प्राप्त करा. मण्यांना त्रास होणार नाही याची काळजी घ्या.
  19. सुपरनॅटंटमध्ये TELL-Seq™ लायब्ररी असते.

टीप:
हा एक सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट आहे. शुद्ध केलेले TELL-Seq लायब्ररी -25°C ते -15°C तापमानात एका महिन्यासाठी साठवले जाऊ शकते.

टार्गेट एनरिचमेंटसाठी लायब्ररी पात्र आणि क्वांटिफाइड करा

उपभोग्य वस्तू

  • Agilent उच्च संवेदनशीलता DNA Kit or TapeStation उच्च संवेदनशीलता D5000 ScreenTape Assay (वापरकर्ता)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (वापरकर्ता)
  • TE बफर, pH 8.0 (वापरकर्ता)

टीप:
इल्युमिना सिस्टीमसाठी मानक qPCR लायब्ररी क्वांटिटेशन परख TELL-Seq लायब्ररीसाठी कार्य करते, परंतु त्याची आवश्यकता नाही.

तयारी

  1. बायोॲनालायझर किंवा टेपस्टेशन आणि क्युबिटद्वारे आवश्यक उपभोग्य वस्तू तयार करा.

कार्यपद्धती

  1. Agilent उच्च संवेदनशीलता DNA किटसाठी 1 µL लायब्ररी वापरा किंवा TapeStation उच्च संवेदनशीलता D2 ScreenTape Assay साठी लायब्ररीचा 5000 µL वापरा.
  2. पासून जतन केलेले अस्वच्छ पीसीआर उत्पादन तपासा Amplify लायब्ररी विभाग त्याच वेळी. अस्वच्छ पीसीआर उत्पादनामध्ये प्राइमर डायमर आणि ॲडॉप्टर डायमरची उच्च पातळी असू शकते. कमी मार्कर सिग्नलमध्ये व्यत्यय आणू नये म्हणून बायोअनालायझर चिप किंवा टेपस्टेशन टेपवर लोड करण्यापूर्वी न्यूक्लिझ-मुक्त पाण्याने दुप्पट पातळ करणे आवश्यक आहे.
  3. चांगल्या आकाराच्या लायब्ररीमध्ये 1000 bp (आकृती 1) अंतर्गत बहुतेक लायब्ररी तुकड्यांमध्ये असणे आवश्यक आहे.युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(21)आकृती 1. माजीampक्लीन अप लायब्ररी प्रोfile टेपस्टेशन उच्च संवेदनशीलता D5000 स्क्रीन टेप परख पासून.
  4. लायब्ररी -25°C ते -15°C तापमानात साठवली जाऊ शकते.
  5. 10 पट पातळ केलेले TELL-Seq™ लायब्ररी बनवाample: TELL-Seq™ लायब्ररीचे 2 µL 18 µL न्यूक्लीज-मुक्त पाण्याने पातळ करा. Qubit dsDNA HS Assay Kit सह एकाग्रता तपासण्यासाठी 4 μL पातळ लायब्ररी वापरा.
  6. SureSelectXT HS टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टम प्रक्रियेत जाणाऱ्या प्रत्येक TELL-Seq™ लायब्ररीच्या एकूण वस्तुमानाची गणना करण्यासाठी एकाग्रता (ng/µL) आणि व्हॉल्यूम वापरा. 500 ng -1,000 ng TELL-Seq™ लायब्ररी प्रति sampइष्टतम परिणामांसाठी le ची शिफारस केली जाते, परंतु लायब्ररी इनपुट 250 ng प्रति s इतके कमीampकार्यक्षमतेवर नकारात्मक परिणाम होऊ शकतो तरीही शक्य आहे.
    टीप:
    हायब्रिडायझेशन आणि कॅप्चर प्रोटोकॉलसाठी व्हॉल्यूम मर्यादा आहेत. 12 μL हे DNA इनपुटसाठी अनुमत कमाल आवाज आहे. DNA लायब्ररी खंड या श्रेणीत येतो याची खात्री करण्यासाठी काळजीपूर्वक विचार केला पाहिजे. संकरीकरण आणि कॅप्चर प्रतिक्रिया मध्ये QC नंतर सर्व उपलब्ध TELL-Seq लायब्ररी साहित्य आदर्शपणे वापरा.
  7. (पर्यायी) TELL-Seq™ लायब्ररी SpeedVac व्हॅक्यूम कॉन्सन्ट्रेटर वापरून केंद्रित केल्या जाऊ शकतात. एकाग्र लायब्ररीसाठी स्पीडव्हॅकचा वापर केला जात असल्यास, नंतर TELL-Seq™ लायब्ररी AMPure XP क्लीनअप चांगल्या पुनर्प्राप्तीसाठी किमान 30 µL न्यूक्लिझ-मुक्त पाण्याने XP मण्यांमधून काढले जाऊ शकते. QC नंतर, स्वच्छ TELL-Seq™ लायब्ररी हायब्रिडायझेशन आणि कॅप्चरसाठी इच्छित व्हॉल्यूमवर केंद्रित केली जाऊ शकते.

टीप:
तयार केलेल्या TELL-Seq™ लायब्ररी वापरून IDT आणि Twist Biosciences सारख्या इतर लक्ष्य संवर्धन प्रणाली वापरल्या जाऊ शकतात. DNA इनपुट म्हणून TELL-Seq™ लायब्ररी वापरून निर्दिष्ट लक्ष्य समृद्धी प्रोटोकॉलचे अनुसरण करा. प्रत्येक प्रोटोकॉलमध्ये तपशीलवार ब्लॉकर्स व्यतिरिक्त TELL-Seq™ TargetSeq ब्लॉकरचा 5ul वापरा.

निश्चित लक्ष्य संवर्धन निवडा
खालील प्रोटोकॉल इल्युमिना पेअर-एंड मल्टीप्लेक्स्ड सिक्वेन्सिंग लायब्ररी प्रोटोकॉल (Agilent, G9702-90000) साठी हायब्रिडायझेशन आणि कॅप्चर भाग SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टममध्ये बदल आहे. बदल TELL-Seq™ WGS लायब्ररी प्रीपला Agilent SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट सिस्टम आणि सर्व Exon V8 कॅप्चर प्रोबसह सुसंगततेसाठी अनुमती देतात. फक्त हायब्रिडायझेशन आणि कॅप्चरसाठी एजिलंट अभिकर्मक 16-प्रतिक्रिया स्वरूपात स्वतंत्रपणे खरेदी केले जाऊ शकतात (Agilent भाग क्रमांक G9916B). इतर लक्ष्य संवर्धन प्रणाली वापरत असल्यास प्रत्येक प्रणालीसाठी निर्दिष्ट प्रोटोकॉलचे अनुसरण करा आणि TELL-Seq™ लायब्ररी डीएनए इनपुट म्हणून बदला. प्रत्येक टार्गेट एनरिचमेंट प्रोटोकॉलमध्ये तपशीलवार ब्लॉकर्स व्यतिरिक्त TELL-Seq™ लक्ष्य ब्लॉकर्सची 5ul देखील आवश्यकता आहे

Exome कॅप्चर पॅनेलमध्ये TELL-Seq™ लायब्ररीला संकरित करा

उपभोग्य वस्तू

  • SureSelect XT HS आणि XT लो इनपुट ब्लॉकर मिक्स, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट, ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 2 (PCR पोस्ट करा), युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(7) निळा)
  • SureSelect RNase Block, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 2 (PCR पोस्ट), युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(18) व्हायलेट)
  • SureSelect Fast Hybridization Buffer, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 2 (PCR पोस्ट), बाटली)
  • TELL-Seq™ लक्ष्य अवरोधक (UST, TELL-Seq™ लक्ष्य अवरोधक बॉक्स, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) पांढरा)
  • SSel XT HS आणि XT लो इनपुट ह्युमन ऑल एक्सॉन V7 (Agilent, SSel XT HS आणि XT लो इनपुट ह्युमन ऑल एक्सॉन V7, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) लाल)
  • न्यूक्लीज-मुक्त पाणी (वापरकर्ता)
  • 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)
  • TELL-Seq™ लायब्ररी (वापरकर्ता)
इनपुट रक्कम प्रतिक्रिया खंड (mL)
500 -1,000 एन.जी 12 एमएल पर्यंत

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    XT HS आणि XT लो इनपुट ब्लॉकर मिक्स नक्की निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-26 -25°C ते -15°C बर्फावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. बर्फावर ठेवा.
    RNase ब्लॉक नक्की निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(22) -25°C ते -15°C बर्फावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर सेंट्रीफ्यूज  थोडक्यात बर्फावर ठेवा.
    SureSelect फास्ट हायब्रिडायझेशन बफर -25°C ते -15°C वितळवून तपमानावर ठेवा
    TELL-Seq™ TargetSeq ब्लॉकर -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. बर्फावर ठेवा.
    TELL-Seq™ डीएनए लायब्ररी -25°C ते -15°C वितळवून बर्फावर ठेवा
    SSel XT HS आणि XT कमी इनपुट मानवी सर्व Exon V8 युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) -85°C ते -75°C बर्फावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. बर्फावर ठेवा.
  2. खालील प्रोग्रामसह थर्मो सायकलरवर हायब्रिडायझेशन प्रोग्राम (HP) सेट करा (गरम झाकण चालू ठेवून). प्रोग्राम सुरू करा, नंतर लगेच विराम बटण दाबा, तुम्ही प्रतिक्रिया सेट करत असताना गरम झाकण तापमानापर्यंत पोहोचू द्या.
विभाग क्रमांक सायकलची संख्या तापमान वेळ
1 1 95°C 5 मिनिटे
2 1 65°C 10 मिनिटे
3 1 65°C 1 मिनिट
4 60 65°C
37°C		 1 मिनिट
3 सेकंद
5 1 65°C धरा

कार्यपद्धती

  1. प्रत्येक तयार केलेल्या TELL-Seq™ लायब्ररीमध्ये 500-1000 ng ठेवाample स्ट्रीप ट्यूबवेलमध्ये टाका आणि नंतर गरज भासल्यास न्यूक्लीज-मुक्त पाण्याचा वापर करून प्रत्येक विहिरीतील अंतिम खंड 12 μl वर आणा. आदर्शपणे एकूण करा amplified TELL-Seq™ लायब्ररी DNA, 500-1000 ng श्रेणीमध्ये आणि सर्व संकरित प्रतिक्रियांसाठी वापरा.
  2. प्रत्येक TELL-Seq™ लायब्ररीला sampचांगले, 5 μl SureSelect XT HS आणि XT लो इनपुट ब्लॉकर मिक्स जोडा आणि 5 μl TELL-Seq™ टार्गेट ब्लॉकर जोडा. विहिरी कॅप करा नंतर 5 सेकंदांसाठी उच्च वेगाने भोवरा. कोणतेही फुगे सोडणारे द्रव गोळा करण्यासाठी स्ट्रिप ट्यूब थोडक्यात फिरवा.
  3. ट्यूब थर्मल सायकलरमध्ये स्थानांतरित करा आणि HP प्रोग्राम सेटअप पुन्हा सुरू करण्यासाठी प्ले बटण दाबा.
    टीप:
    सेगमेंट 3 (HP पहा) दरम्यान थर्मल सायकलरला विराम देणे आवश्यक आहे जेणेकरुन हायब्रिडायझेशन विहिरींमध्ये अतिरिक्त अभिकर्मक जोडता येतील, चरण 6 मध्ये वर्णन केले आहे. थर्मल सायकलिंग प्रोग्रामच्या विभाग 1 आणि 2 दरम्यान, मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे अतिरिक्त अभिकर्मक तयार करणे सुरू करा. पायरी 4 आणि पायरी 5. आवश्यक असल्यास, सेगमेंट 3 मध्ये थर्मल सायकलरला विराम दिल्यानंतर तुम्ही या तयारीच्या पायऱ्या पूर्ण करू शकता.
  4. खालील तक्त्यानुसार SureSelect RNase Block चे 25% द्रावण तयार करा (ज्यामध्ये RNase Block चा 1 व्हॉल्यूम 3 वॉल्यूम पाणी आहे). रनमध्ये संकरित प्रतिक्रियांच्या संख्येसाठी आवश्यक असलेली रक्कम तयार करा, तसेच अतिरिक्त.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    1 प्रतिक्रियेसाठी खंड 8 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश) 24 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश)
    RNase ब्लॉक नक्की निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(18) 0.5 मिली 4.5 मिली 12.5 मिली
    Nuclease- मुक्त पाणी 1.5 मिली 13.5 मिली 37.5 मिली
  5. खालील क्रमाने कॅप्चर लायब्ररी हायब्रिडायझेशन मिक्स तयार करा.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (mL)
    1 प्रतिक्रियेसाठी खंड 8 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश) 24 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश)
    25% RNase ब्लॉक सोल्यूशन 2 मिली 18 मिली 50 मिली
    SSel XT HS आणि XT कमी इनपुट

    मानवी सर्व एक्सॉन V7 युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13)

    		 5 मिली 45 मिली 125 मिली
    SureSelect फास्ट हायब्रिडायझेशन बफर 6 मिली 54 मिली 150 मिली

    खोलीच्या तपमानावर सूचीबद्ध अभिकर्मक एकत्र करा. 5 सेकंदांसाठी उच्च वेगाने व्हर्टेक्स करून चांगले मिसळा आणि नंतर थोडक्यात फिरा. चरण 6 वर त्वरित पुढे जा.

  6. एकदा थर्मल सायकलर HP च्या सेगमेंट 3 (1°C वर 65 मिनिट) सुरू झाल्यावर, पॉज बटण दाबा. सायकलरला विराम देऊन, आणि DNA + ब्लॉकर s ठेवत असतानाamples in the cycler, 13 µl खोलीचे तापमान- कॅप्चर लायब्ररी हायब्रिडायझेशन मिक्स चरण 6 पासून प्रत्येक s मध्ये हस्तांतरित कराampचांगले. 8 ते 10 वेळा हळूहळू वर आणि खाली पाइपिंग करून चांगले मिसळा. संकरीकरण प्रतिक्रिया विहिरींमध्ये आता अंदाजे 35 μl आहे
  7. सर्व विहिरी पूर्णपणे सील केल्या आहेत याची खात्री करा. व्होर्टेक्स थोडक्यात, नंतर विहिरीच्या तळापासून कोणतेही बुडबुडे काढण्यासाठी स्ट्रिप ट्यूब थोडक्यात फिरवा. ताबडतोब स्ट्रिप ट्यूब थर्मल सायकलरवर परत करा.
  8. तयार DNA s चे संकरीकरण होण्यासाठी थर्मल सायकलिंग प्रोग्राम पुन्हा सुरू करण्यासाठी प्ले बटण दाबाampकॅप्चर लायब्ररीकडे जा.

Streptavidin-लेपित चुंबकीय मणी तयार करा

उपभोग्य वस्तू

  • Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (वापरकर्ता)
  • SureSelect बंधनकारक बफर (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 1 (PCR पोस्ट करा), CAP)

तयारी

खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:

आयटम स्टोरेज सूचना
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 2°C ते 8°C जोमाने सेंट्रीफ्यूज करा. खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
बंधनकारक बफर निश्चितपणे निवडा, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.

कार्यपद्धती

  1. डायनाबीड्स MyOne Streptavidin T1 चुंबकीय मणी व्होर्टेक्स मिक्सरवर जोमाने पुन्हा लावा. स्टोरेज दरम्यान चुंबकीय मणी स्थिर होतात.
  2. प्रत्येक संकरीकरणासाठी एसample, ताज्या पीसीआर प्लेट किंवा स्ट्रीप ट्यूबच्या विहिरींमध्ये 50 μl पुनरुत्पादित मणी घाला.
  3. 200 μl SureSelect Binding Buffer जोडून मणी धुवा. 20 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून मिसळा किंवा 5-10 सेकंदांसाठी उच्च वेगाने विहिरी आणि भोवरा कॅप करा.
  4. चुंबकीय विभाजक उपकरणामध्ये प्लेट किंवा स्ट्रिप ट्यूब ठेवा.
  5. किमान 5 मिनिटे किंवा सोल्यूशन स्पष्ट होईपर्यंत प्रतीक्षा करा, नंतर सुपरनाटंट काढा आणि टाकून द्या.
  6. एकूण 3 वॉशसाठी पायऱ्या 5-3 आणखी दोन वेळा पुन्हा करा.
  7. SureSelect Binding Buffer च्या 200 μl मध्ये मणी पुन्हा जोडा.

स्ट्रेप्टाव्हिडिन-लेपित मणी वापरून हायब्रिडाइज्ड डीएनए कॅप्चर करा

उपभोग्य वस्तू

  • SureSelect Wash Buffer 1, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 1 (PCR पोस्ट करा), युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3))
  • नक्की धुवा निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) बफर 2, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट ILM Hyb मॉड्यूल, बॉक्स 1 (PCR पोस्ट), युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3))

तयारी

खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:

आयटम स्टोरेज सूचना
सुनिश्चित करा वॉश बफर 1 निवडा, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
सुनिश्चित करा वॉश बफर 2 निवडा, युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(3) खोलीचे तापमान 200 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 70 μl एलिकोट्स गरम करा. पायरी 4 पहा

कार्यपद्धती

  1. हायब्रिडायझेशनची पायरी पूर्ण झाल्यानंतर आणि थर्मल सायकलर 65 डिग्री सेल्सिअस होल्ड स्टेपवर पोहोचल्यानंतर, एस स्थानांतरित कराampखोलीच्या तापमानापर्यंत.
  2. मल्टीचॅनल पिपेट वापरून 30 μl धुतलेले स्ट्रेप्टाव्हिडिन मणी असलेल्या प्रत्येक संकरित मिश्रणाचा संपूर्ण खंड (अंदाजे 200 μl) ताबडतोब हस्तांतरित करा. मिसळण्यासाठी वर आणि खाली 5-8 वेळा पिपेट करा.
  3. कॅप्चर स्ट्रिप ट्यूब 96-वेल प्लेट मिक्सरवर जोमाने मिसळून (1400-1800 rpm वर) किंवा रोटेटरमध्ये खोलीच्या तापमानाला 30 मिनिटे उबवा. याची खात्री करा की एसamples विहिरींमध्ये व्यवस्थित मिसळत आहेत.
  4. उष्मायनानंतर लगेच पुढील चरणावर जा. कॅप्चरसाठी 30-मिनिटांच्या उष्मायन दरम्यान, खाली वर्णन केल्याप्रमाणे 2°C वर SureSelect Wash Buffer 70 प्रीवॉर्म करा. वॉश बफर 200 चे 2 μl aliquots ताज्या 96- वेल प्लेट किंवा स्ट्रिप ट्यूबच्या विहिरीमध्ये ठेवा. प्रत्येक DNA s साठी बफरच्या 6 विहिरीampधावत आहे. विहिरी कॅप करा आणि नंतर थर्मल सायकलरमध्ये उष्मायन करा, गरम झाकण चालू ठेवा, वापरेपर्यंत 70 डिग्री सेल्सिअस तापमानात ठेवा
  5. पायरी 30 मध्ये सुरू केलेला 3-मिनिटांचा उष्मायन कालावधी पूर्ण झाल्यावर, s फिरवाamples थोडक्यात द्रव गोळा करण्यासाठी.
  6. मणी गोळा करण्यासाठी पट्टीची नळी चुंबकीय विभाजकात ठेवा. सोल्यूशन स्पष्ट होईपर्यंत प्रतीक्षा करा, नंतर सुपरनाटंट काढा आणि टाकून द्या.
  7. SureSelect Wash Buffer 200 च्या 1 μl मध्ये मणी पुन्हा सस्पेंड करा. मणी पूर्णपणे पुन्हा निलंबित होईपर्यंत 15-20 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून मिक्स करा.
  8. चुंबकीय विभाजक मध्ये पट्टी ट्यूब ठेवा. सोल्यूशन साफ ​​होण्याची प्रतीक्षा करा (अंदाजे 1 मिनिट), नंतर सुपरनॅटंट काढा आणि टाकून द्या.
  9. चुंबकीय विभाजकातून स्ट्रिप ट्यूब काढा आणि खोलीच्या तपमानावर रॅकमध्ये स्थानांतरित करा. 200 µl 70 डिग्री सेल्सिअस प्रीवार्म्ड वॉश बफर 2 मध्ये मणी पुन्हा लावा. जोपर्यंत मणी पूर्णत: पुन्हा निलंबित होत नाहीत तोपर्यंत 15-20 वेळा वर आणि खाली पिपेट करा. ताज्या कॅप्ससह विहिरी सील करा आणि नंतर 8 सेकंदांसाठी उच्च वेगाने भोवरा. मणी न पेलता द्रव गोळा करण्यासाठी प्लेट किंवा स्ट्रिप ट्यूब थोडक्यात फिरवा.
  10. s उबवणेampगरम झाकण ठेवून थर्मल सायकलरवर 5°C वर 70 मिनिटे ठेवा.
  11. खोलीच्या तपमानावर चुंबकीय विभाजक मध्ये पट्टी ट्यूब ठेवा. सोल्यूशन साफ ​​होण्यासाठी 1 मिनिट प्रतीक्षा करा, नंतर सुपरनाटंट काढा आणि टाकून द्या.
  12. एकूण 9 वॉशसाठी पायऱ्या 11-6 आणखी पाच वेळा पुन्हा करा.
  13. सर्व वॉश बफर काढून टाकले गेल्याची पडताळणी केल्यानंतर, प्रत्येक s मध्ये 25 µl न्यूक्लिझ-मुक्त पाणी घाला.ampचांगले. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी 8 वेळा वर आणि खाली पिपेट करा. एसamples आधी बर्फावर साठवले जाऊ शकते ampबंधन

Amplify कॅप्चर केलेली लायब्ररी

उपभोग्य वस्तू

  • 5× हरकुलेज II प्रतिक्रिया बफर (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट, ILM Hyb मॉड्यूल बॉक्स 2 (PCR पोस्ट करा), CAP क्लियर)
  • हर्क्युलेज II फ्यूजन डीएनए पॉलिमरेझ (एजिलेंट, शुअर सिलेक्ट एक्सटी एचएस टार्गेट एनरिचमेंट किट, आयएलएम हायब मॉड्यूल बॉक्स 2 (पीसीआर पोस्ट), सीएपी रेड)
  • 100 mM dNTP मिक्स, (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट, ILM Hyb मॉड्यूल बॉक्स 2 (PCR पोस्ट), CAP ग्रीन)
  • SureSelect Post-Capture Primer Mix (Agilent, SureSelect XT HS टार्गेट एनरिचमेंट किट, ILM Hyb मॉड्यूल बॉक्स 2 (PCR पोस्ट करा), CAP Clear)

तयारी

  1. खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:
    आयटम स्टोरेज सूचना
    5× हरकुलेज II प्रतिक्रिया बफर युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. भोवरा ते मिसळा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा. बर्फावर ठेवा.     
    हरकुलेज II फ्यूजन डीएनए पॉलिमरेझ युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(13) -25°C ते -15°C सेंट्रीफ्यूज थोडक्यात. बर्फावर ठेवा.
    100 मिमी dNTP मिक्स युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(20) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. भोवरा ते  मिसळा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा. बर्फावर ठेवा.     
    पोस्ट-कॅप्चर प्राइमर मिक्स नक्की निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) -25°C ते -15°C खोलीच्या तपमानावर वितळवा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा, नंतर थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज. बर्फावर ठेवा.
  2. थर्मो सायकलरवर खालीलप्रमाणे प्रोग्राम सेट करा:
    • 98°C 2 मिनिटे
    • [98°C 30 सेकंद, 63°C 30 सेकंद, 72°C 1 मिनिट] x 9
    • 72°C 5 मिनिटे
    • 4°C कायमचे

कार्यपद्धती

  1. PCR प्रतिक्रिया मिश्रणाची योग्य मात्रा तयार करा. प्रतिक्रियांच्या संख्येवर आधारित PCR ट्यूबमध्ये खालील अभिकर्मक जोडा.
    अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया खंड (µL)
    1 प्रतिक्रियेसाठी खंड 8 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश) 24 प्रतिक्रियांसाठी खंड (अतिरिक्त समावेश)
    Nuclease- मुक्त पाणी ०.४ μL ०.४ μL ०.४ μL
    5× हरकुलेज II प्रतिक्रिया बफरयुनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) ०.४ μL ०.४ μL ०.४ μL
    हरकुलेज II फ्यूजन डीएनए पॉलिमरेझ युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-27 ०.४ μL ०.४ μL ०.४ μL
    100 मिमी dNTP मिक्स युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(20) ०.४ μL ०.४ μL ०.४ μL
    पोस्ट-कॅप्चर प्राइमर मिक्स नक्की निवडा युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(4) ०.४ μL ०.४ μL ०.४ μL
  2. PCR प्रतिक्रिया मिश्रणाची योग्य मात्रा तयार करा. प्रतिक्रियांच्या संख्येवर आधारित PCR ट्यूबमध्ये खालील अभिकर्मक जोडा. टेबल 25 मध्ये तयार केलेले PCR प्रतिक्रिया मिश्रणाचे 29 μl प्रत्येक s मध्ये जोडाample विहीर ज्यामध्ये 25 µl मणी-बद्ध लक्ष्य-समृद्ध DNA (पृष्ठ 26 वर तयार केलेले आणि बर्फावर धरलेले).
  3. मणी सस्पेंशन एकसंध होईपर्यंत वर आणि खाली पाइपिंग करून पीसीआर प्रतिक्रिया चांगल्या प्रकारे मिसळा. स्प्लॅशिंग टाळाampविहिरीच्या भिंतींवर लेस; s फिरवू नकाampया टप्प्यावर les.
  4. थर्मल सायकलरवर ट्यूब ठेवा आणि योग्य संख्येच्या सायकलसह प्रोग्राम (वर पहा) चालवा.
  5. जेव्हा पीसीआर ampलिफिकेशन प्रोग्राम पूर्ण झाला आहे, स्ट्रिप ट्यूब थोडक्यात फिरवा. खोलीच्या तपमानावर चुंबकीय स्टँडवर प्लेट किंवा स्ट्रिप ट्यूब ठेवून स्ट्रेप्टाव्हिडिन-कोटेड मणी काढा. द्रावण साफ होण्यासाठी 2 मिनिटे प्रतीक्षा करा, नंतर प्रत्येक सुपरनेटंट (अंदाजे 50 μl) स्ट्रिप ट्यूबच्या विहिरीमध्ये काढा.

कॅप्चर केलेली लायब्ररी साफ करा 

उपभोग्य वस्तू

  • AMPure XP (वापरकर्ता)
  • आण्विक जीवशास्त्र (वापरकर्ता) साठी इथेनॉल 200 पुरावा (निरपेक्ष)
  • न्यूक्लीज-मुक्त पाणी (वापरकर्ता)
  • TE बफर, pH 8.0 (वापरकर्ता)
  • 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब किंवा स्ट्रिप ट्यूब (वापरकर्ता)

तयारी

खालील उपभोग्य वस्तू तयार करा:

आयटम स्टोरेज सूचना
ताजे 75% (v/v) इथेनॉल खोलीचे तापमान 400 mL प्रति s आवश्यक आहेampले १.५ मिली इथेनॉल (२०० प्रूफ) ०.५ मिली न्यूक्लीज-मुक्त पाण्यात मिसळा. मिक्स करण्यासाठी भोवरा आणि खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
AMPure XP 2°C ते 8°C किमान 20 मिनिटे खोलीच्या तपमानावर आणा आणि वापरण्यापूर्वी मणी पुन्हा सुरू करण्यासाठी जोमाने भोवरा.
Nuclease- मुक्त पाणी खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.
TE बफर, pH 8.0 खोलीचे तापमान खोलीच्या तपमानावर ठेवा.

कार्यपद्धती

  1. सेंट्रीफ्यूजमध्ये द्रुत ~1 सेकंद फिरवून समाधान खाली आणा.
  2. भोवरा जोमाने पुन्हा निलंबित करण्यासाठी AMPure XP सोल्यूशन आणि 50 μL जोडा AMPप्रत्येक पीसीआर उत्पादनामध्ये ure XP.
  3. 10 वेळा वर आणि खाली पाइपिंग करून मिसळा.
  4. खोलीच्या तपमानावर 5 मिनिटे उष्मायन करा.
  5. ट्यूबला चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  6. त्रास न होता सुपरनॅटंट ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या AMPure मणी.
  7. चुंबकीय स्टँडवर ट्यूब ठेवताना, ट्यूबमध्ये 200 μL ताजे तयार केलेले 75% इथेनॉल घाला. 30 सेकंद बसू द्या.
  8. मणींना त्रास न देता वरवरच्या तपकिरी पदार्थाला ऍस्पिरेट करा आणि टाकून द्या.
  9. ट्यूबला संपूर्ण वेळ चुंबकीय स्टँडवर ठेवून आणखी एकदा 7-8 चरणांची पुनरावृत्ती करा.
  10. ट्यूबला मॅग्नेटिक स्टँडवर कॅप उघडी ठेवा आणि इथेनॉलच्या खुणा बाष्पीभवन करण्यासाठी ट्यूबला 1-2 मिनिटे कोरडे होऊ द्या. मणी जास्त वाळवू नका.
  11. चुंबकीय स्टँडमधून ट्यूब काढा आणि मण्यांना 25 μL TE बफर घाला.
  12. मणी पुन्हा निलंबित करण्यासाठी पिपेट किंवा भोवरा. 5 मिनिटे बसू द्या.
  13. ट्यूबला चुंबकीय स्टँडवर 1 मिनिट किंवा द्रावण स्पष्ट होईपर्यंत ठेवा.
  14. एका नवीन ट्यूबमध्ये 23 μL सुपरनॅटंट पुनर्प्राप्त करा. मण्यांना त्रास होणार नाही याची काळजी घ्या.
  15. सुपरनॅटंटमध्ये कॅप्चर केलेली TELL-Seq™ लायब्ररी आहे.

टीप:
हा एक सुरक्षित स्टॉपिंग पॉइंट आहे. कॅप्चर केलेली TELL-Seq लायब्ररी सहा महिन्यांसाठी -25°C ते -15°C तापमानात साठवली जाऊ शकते.

अनुक्रमणासाठी कॅप्चर केलेली लायब्ररी पात्र आणि प्रमाणीकरण करा

उपभोग्य वस्तू

  • Agilent Bioanalyzer उच्च संवेदनशीलता DNA Kit or TapeStation उच्च संवेदनशीलता D5000 ScreenTape Assay (वापरकर्ता)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (वापरकर्ता)
  • TE बफर, pH 8.0 (वापरकर्ता)

तयारी

  1. बायोॲनालायझर किंवा टेपस्टेशन आणि क्युबिटद्वारे आवश्यक उपभोग्य वस्तू तयार करा.

कार्यपद्धती

  1. Agilent Bioanalyzer उच्च संवेदनशीलता DNA किटसाठी 1 µL लायब्ररी वापरा किंवा TapeStation उच्च संवेदनशीलता D2 ScreenTape Assay साठी लायब्ररीचा 5000 µL वापरा.
  2. लायब्ररी एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी, 150 bp ते 1000 bp पर्यंत Bioanalyzer किंवा TapeStation विश्लेषण सॉफ्टवेअरवर क्षेत्र सेट करा. रेकॉर्ड एसampया प्रदेशासाठी एकाग्रता (nM) (आकृती 2 पहा). लायब्ररीचा आकार निश्चित करण्यासाठी, प्रदेश 150 bp वरून 3000 bp वर सेट करा. रेकॉर्ड एसampलायब्ररीचा आकार म्हणून सरासरी आकार (bp).
    खबरदारी
    बायोॲनालायझर (किंवा टेपस्टेशन) मधील एकाग्रता वाचन क्रमवारीसाठी आवश्यक सौम्यता किंवा लायब्ररी पूलिंग करण्यासाठी प्रारंभ बिंदू म्हणून वापरले पाहिजे. Qubit dsDNA HS Assay किटसह अंतिम पातळ केलेल्या सिक्वेन्सिंग लायब्ररी किंवा लायब्ररी पूलची एकाग्रता सत्यापित करा (चरण 6 पहा).युनिव्हर्सल-सेक्वेंसींग-टेल-सेक-लक्ष्य-संवर्धन-(23)आकृती 2. माजीample of exome captured library profile टेप स्टेशनवरून उच्च संवेदनशीलता D5000 स्क्रीन टेप परख.
  3. लायब्ररी ताबडतोब अनुक्रमित केली जाऊ शकते किंवा -25°C ते -15°C वर संग्रहित केली जाऊ शकते.
  4. अनुक्रम करताना, प्रत्येक Illumina® अनुक्रमण प्रणालीने शिफारस केलेल्या एकाग्रतेनुसार TE बफर वापरून लायब्ररी पातळ करा. एकाच रनमध्ये एकापेक्षा जास्त लायब्ररी अनुक्रमित केल्या गेल्यास अनुक्रमासाठी पातळ लायब्ररी पूल बनवा.
  5. Qubit dsDNA HS Assay Kit सह लायब्ररी एकाग्रता मोजा. वस्तुमान एकाग्रतेचे मोलर कॉन्सन्ट्रेशन (nM) मध्ये रूपांतर करण्यासाठी बायोअनालायझर (किंवा टेपस्टेशन) मापनातील सरासरी आकार मूल्य लायब्ररी आकार म्हणून वापरा.

A = वस्तुमान एकाग्रता (ng/µL)
S = लायब्ररी आकार (bp)
मोलर एकाग्रता (nM) = (A*1,000,000)/(S*650)
Qubit द्वारे मोजलेले लायब्ररी एकाग्रता 10% पेक्षा जास्त शिफारस केलेल्या एकाग्रतेपेक्षा भिन्न असल्यास अनुक्रम तयार करण्यासाठी आवश्यक असलेला आवाज समायोजित करा.

कागदपत्रे / संसाधने

युनिव्हर्सल सिक्वेन्सिंग टेल-सेक लक्ष्य संवर्धन [pdf] वापरकर्ता मार्गदर्शक
TELL-Seq लक्ष्य संवर्धन, TELL-Seq, लक्ष्य संवर्धन, संवर्धन

संदर्भ

संबंधित पोस्ट

एक टिप्पणी द्या

तुमचा ईमेल पत्ता प्रकाशित केला जाणार नाही. आवश्यक फील्ड चिन्हांकित आहेत *